zhpsЖурнал прикладной спектроскопииZhurnal Prikladnoii Spektroskopii0514-7506B. I. Stepanov Institute of Physics of the National Academy of Scienceszhps-1612Research ArticleПРИБОРЫ И МЕТОДЫ СПЕКТРОСКОПИИDEVICES AND METHODS OF SPECTROSCOPYАнализ пространственных распределений числа фотоотсчетов во флуоресцентной флуктуационной спектроскопииAnalysis of Spatial Photon Counting Distributions in Fluorescence Fluctuation SpectroscopyСкакунВ. В.SkakunV. V.

Минск

Minsk

skakun@bsu.byХинкM. A.HinkM. A.

Амстердам

Amsterdam

АпанасовичВ. В.ApanasovichV. V.

Минск

Minsk

Белорусский государственный университетBelarusian State UniversityАмстердамский университет, Центр передовой микроскопии Антони ван ЛевенгукаUniversity of Amsterdam, dept Molecular Cytology, van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy202401082024914571580Copyright © Скакун В.В., Хинк M.A., Апанасович В.В., 20242024Скакун В.В., Хинк M.A., Апанасович В.В.Skakun V.V., Hink M.A., Apanasovich V.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://zhps.ejournal.by/jour/article/view/1612

Предложен метод анализа распределения числа фотоотсчетов (РЧФ), вычисленных по пространству (пикселям) стека флуоресцентных изображений, получаемых в процессе сканирующего измерения в флуоресцентной флуктуационной спектроскопии, позволяющий определять характеристическую яркость и количество молекул исследуемого вещества. Метод применим для эргодических систем и основан на теории анализа гистограмм счета фотонов PCH (Photon Counting Histogram), разработанного для одноточечных измерений. Выполнено тестирование метода на экспериментально полученных изображениях зеленого флуоресцирующего белка. Проведено сравнение полученных результатов с результатами одноточечного эксперимента и метода N&B (Number and Brightness), наиболее часто применяемого для численного анализа стека флуоресцентных изображений, полученных в сканирующих экспериментах. Оценки характеристической яркости и количества молекул исследуемого вещества хорошо согласуются с оценками, полученными с помощью используемых в данной области методов анализа, что позволяет сделать вывод о возможности применения теории метода PCH для анализа пространственных РЧФ, рассчитанных на основе стека изображений. Разработанный метод позволяет получать оценки исследуемых параметров на основе выделенной подобласти одного фрейма изображения.

The proposed method for analyzing photon counting distributions (PCD), calculated over the space (pixels) of a stack of fluorescent images obtained in the process of scanning measurement in fluorescence fluctuation spectroscopy, makes it possible to determine the characteristic brightness and number of molecules of the investigated substance. The method is valid for ergodic systems and is based on the theory of analysis of photon count histograms PCH (Photon Counting Histogram), developed for the analysis of single-point measurements. The method has been tested on the experimentally obtained images of green fluorescent protein. The results are compared with the results of a single-point experiment and the N&B (Number and Brightness) method, which is most often used for numerical analysis of a stack of fluorescent images obtained in scanning experiments. The resulting estimates of the characteristic brightness and number of molecules of the calculated substance are in good agreement with the estimates obtained using analysis methods in this area, which allows us to conclude that it is possible to use the theory of the PCH method for the analysis of spatial PCD calculated based on a stack of images. The developed method makes it possible to obtain estimates of the observed parameters based on a selected subregion of one image frame.

флуоресцентная флуктуационная спектроскопиясканирующая микроскопияанализ распределения числа фотоотсчетовметод N&Bанализ гистограмм счета фотонов PCHметод FIDAфлуоресцентные изображенияfluorescence fluctuation spectroscopyscanning microscopyanalysis of photocount number distributionN&B methodanalysis of photon counting histogramsFIDA methodfluorescent imagesReferencesD. Magde, E. Elson, W. W. Webb. Phys. Rev. Lett., 29 , N 11 (1972) 705—708, doi: 10.1103/PhysRevLett.29.705D. Magde, E. Elson, W. W. Webb. Phys. Rev. Lett., 29 , N 11 (1972) 705—708, doi: 10.1103/PhysRevLett.29.705E. L. Elson. Biophys. J., 101 , N 12 (2011) 2855—2870, doi: 10.1016/j.bpj.2011.11.012E. L. Elson. Biophys. J., 101 , N 12 (2011) 2855—2870, doi: 10.1016/j.bpj.2011.11.012M. A. Hink. Protoplasma, 251 , N 2 (2014) 307—316, doi: 10.1007/S00709-013-0602-ZM. A. Hink. Protoplasma, 251 , N 2 (2014) 307—316, doi: 10.1007/S00709-013-0602-ZR. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P. Kask. Eur. Biophys. J., 22 , N 3 (1993) 169—175, doi: 10.1007/BF00185777R. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P. Kask. Eur. Biophys. J., 22 , N 3 (1993) 169—175, doi: 10.1007/BF00185777S. T. Hess, W. W. Webb. Biophys. J., 83 , N 4 (2002) 2300—2317, doi: 10.1016/S0006-3495(02)73990-8S. T. Hess, W. W. Webb. Biophys. J., 83 , N 4 (2002) 2300—2317, doi: 10.1016/S0006-3495(02)73990-8E. L. Elson, D. Magde. Biopolymers, 13 , N 1 (1974) 1—27, doi: 10.1002/BIP.1974.360130102E. L. Elson, D. Magde. Biopolymers, 13 , N 1 (1974) 1—27, doi: 10.1002/BIP.1974.360130102Y. Chen, J. D. Müller, P. T. C. So, E. Gratton. Biophys. J., 77 , N 1 (1999) 553—567, doi: 10.1016/S0006-3495(99)76912-2Y. Chen, J. D. Müller, P. T. C. So, E. Gratton. Biophys. J., 77 , N 1 (1999) 553—567, doi: 10.1016/S0006-3495(99)76912-2P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 , N 24 (1999) 13756—13761, doi: 10.1073/PNAS.96.24.13756P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 , N 24 (1999) 13756—13761, doi: 10.1073/PNAS.96.24.13756В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2008) 31—35В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2008) 31—35В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2016) 52—59В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2016) 52—59Lan Yu, Yunze Lei, Ying Ma, Min Liu, Juanjuan Zheng, Dan Dan, Peng Gao. Front Phys., 9 (2021) 110, doi: 10.3389/FPHY.2021.644450/BIBTEXLan Yu, Yunze Lei, Ying Ma, Min Liu, Juanjuan Zheng, Dan Dan, Peng Gao. Front Phys., 9 (2021) 110, doi: 10.3389/FPHY.2021.644450/BIBTEXA. Kitamura, M. Kinjo. Int. J. Mol. Sci., 19 , N 4 (2018) 964, doi: 10.3390/IJMS19040964A. Kitamura, M. Kinjo. Int. J. Mol. Sci., 19 , N 4 (2018) 964, doi: 10.3390/IJMS19040964L. M. Nederveen-Schippers, P. Pathak, I. Keizer-Gunnink, A. H. Westphal, P. J. M. van Haastert, J. W. Borst, A. Kortholt, V. V. Skakun. Int. J. Mol. Sci., 22 , N 14 (2021) 7300, doi: 10.3390/IJMS22147300L. M. Nederveen-Schippers, P. Pathak, I. Keizer-Gunnink, A. H. Westphal, P. J. M. van Haastert, J. W. Borst, A. Kortholt, V. V. Skakun. Int. J. Mol. Sci., 22 , N 14 (2021) 7300, doi: 10.3390/IJMS22147300K. Palo, Ü. Mets, S. Jäger, P. Kask, K. Gall. Biophys. J., 79 , N 6 (2000) 2858—2866, doi: 10.1016/S0006-3495(00)76523-4K. Palo, Ü. Mets, S. Jäger, P. Kask, K. Gall. Biophys. J., 79 , N 6 (2000) 2858—2866, doi: 10.1016/S0006-3495(00)76523-4B. Huang, T. D. Perroud, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 5 , N 10 (2004) 1523—1531, doi: 10.1002/CPHC.200400176B. Huang, T. D. Perroud, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 5 , N 10 (2004) 1523—1531, doi: 10.1002/CPHC.200400176J. D. Müller. Biophys. J., 86 , N 6 (2004) 3981—3992, doi: 10.1529/biophysj.103.037887J. D. Müller. Biophys. J., 86 , N 6 (2004) 3981—3992, doi: 10.1529/biophysj.103.037887B. Wu, R. H. Singer, J. D. Mueller. Methods Enzymol., 518 (2013) 99—119, doi: 10.1016/B978-0-12-388422-0.00005-4B. Wu, R. H. Singer, J. D. Mueller. Methods Enzymol., 518 (2013) 99—119, doi: 10.1016/B978-0-12-388422-0.00005-4V. V. Skakun, A. V. Digris, V. V. Apanasovich. Methods Mol. Biol., 1076 (2014) 719—741, doi: 10.1007/978-1-62703-649-8_33V. V. Skakun, A. V. Digris, V. V. Apanasovich. Methods Mol. Biol., 1076 (2014) 719—741, doi: 10.1007/978-1-62703-649-8_33J. M. Beechem. Methods Enzymol., 210 , N C (1992) 37—54, doi: 10.1016/0076-6879(92)10004-WJ. M. Beechem. Methods Enzymol., 210 , N C (1992) 37—54, doi: 10.1016/0076-6879(92)10004-WV. V. Skakun, M. A. Hink, A. V. Digris, R. Engel, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, A. J. W. G. Visser. Eur. Biophys. J., 34 , N 4 (2005) 323—334, doi: 10.1007/s00249-004-0453-9V. V. Skakun, M. A. Hink, A. V. Digris, R. Engel, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, A. J. W. G. Visser. Eur. Biophys. J., 34 , N 4 (2005) 323—334, doi: 10.1007/s00249-004-0453-9M. A. Digman, R. Dalal, A. F. Horwitz, E. Gratton. Biophys J., 94 , N 6 (2008) 2320—2332, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.107.114645M. A. Digman, R. Dalal, A. F. Horwitz, E. Gratton. Biophys J., 94 , N 6 (2008) 2320—2332, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.107.114645J. R. Unruh, E. Gratton. Biophys. J., 95 , N 11 (2008) 5385—5398, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.108.130310J. R. Unruh, E. Gratton. Biophys. J., 95 , N 11 (2008) 5385—5398, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.108.130310H. Balasubramanian, J. Sankaran, S. Pandey, C. J. H. Goh, T. Wohland. Biophys. J., 121 , N 23 (2022) 4452—4466, doi: 10.1016/j.bpj.2022.11.003H. Balasubramanian, J. Sankaran, S. Pandey, C. J. H. Goh, T. Wohland. Biophys. J., 121 , N 23 (2022) 4452—4466, doi: 10.1016/j.bpj.2022.11.003V. V. Skakun, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, H. J. Tanke, A. M. Deelder, O. A. Mayboroda. Eur. Biophys. J., 35 , N 5 (2006) 410—423, doi: 10.1007/s00249-006-0048-8V. V. Skakun, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, H. J. Tanke, A. M. Deelder, O. A. Mayboroda. Eur. Biophys. J., 35 , N 5 (2006) 410—423, doi: 10.1007/s00249-006-0048-8V. V. Skakun, E. G. Novikov, T. V. Apanasovich, V. V. Apanasovich. Methods Appl. Fluoresc., 3 , N 4 (2015) 045003, doi: 10.1088/2050-6120/3/4/045003V. V. Skakun, E. G. Novikov, T. V. Apanasovich, V. V. Apanasovich. Methods Appl. Fluoresc., 3 , N 4 (2015) 045003, doi: 10.1088/2050-6120/3/4/045003G. J. Kremers, J. Goedhart, D. J. Van Den Heuvel, H. C. Gerritsen, T. W. J. Gadella. Biochemistry, 46 , N 12 (2007) 3775—3783, doi: 10.1021/BI0622874G. J. Kremers, J. Goedhart, D. J. Van Den Heuvel, H. C. Gerritsen, T. W. J. Gadella. Biochemistry, 46 , N 12 (2007) 3775—3783, doi: 10.1021/BI0622874J. R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer, New York (2006), doi: 10.1007/978-0-387-46312-4J. R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer, New York (2006), doi: 10.1007/978-0-387-46312-4В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Журн. БГУ. Физика, 2 (2023) 22—38, doi: 10.33581/2520-2243-2023-2-22-38В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Журн. БГУ. Физика, 2 (2023) 22—38, doi: 10.33581/2520-2243-2023-2-22-38M. L. Johnson, L. M. Faunt. Methods Enzymol., 210 (1992) 1—37, doi: 10.1016/0076-6879(92)10003-VM. L. Johnson, L. M. Faunt. Methods Enzymol., 210 (1992) 1—37, doi: 10.1016/0076-6879(92)10003-VT. D. Perroud, B. Huang, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 6 , N 5 (2005) 905—912, doi: 10.1002/cphc.200400547T. D. Perroud, B. Huang, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 6 , N 5 (2005) 905—912, doi: 10.1002/cphc.200400547P. R. Bevington, D. K. Robinson. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences, 3rd ed., McGraw-Hill Publishing Co. (2003), ISBN 0072472278/9780072472271P. R. Bevington, D. K. Robinson. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences, 3rd ed., McGraw-Hill Publishing Co. (2003), ISBN 0072472278/9780072472271

The authors declare that there are no conflicts of interest present.