Анализ пространственных распределений числа фотоотсчетов во флуоресцентной флуктуационной спектроскопии

Предложен метод анализа распределения числа фотоотсчетов (РЧФ), вычисленных по пространству (пикселям) стека флуоресцентных изображений, получаемых в процессе сканирующего измерения в флуоресцентной флуктуационной спектроскопии, позволяющий определять характеристическую яркость и количество молекул исследуемого вещества. Метод применим для эргодических систем и основан на теории анализа гистограмм счета фотонов PCH (Photon Counting Histogram), разработанного для одноточечных измерений. Выполнено тестирование метода на экспериментально полученных изображениях зеленого флуоресцирующего белка. Проведено сравнение полученных результатов с результатами одноточечного эксперимента и метода N&B (Number and Brightness), наиболее часто применяемого для численного анализа стека флуоресцентных изображений, полученных в сканирующих экспериментах. Оценки характеристической яркости и количества молекул исследуемого вещества хорошо согласуются с оценками, полученными с помощью используемых в данной области методов анализа, что позволяет сделать вывод о возможности применения теории метода PCH для анализа пространственных РЧФ, рассчитанных на основе стека изображений. Разработанный метод позволяет получать оценки исследуемых параметров на основе выделенной подобласти одного фрейма изображения.

1. D. Magde, E. Elson, W. W. Webb. Phys. Rev. Lett., 29 , N 11 (1972) 705—708, doi: 10.1103/PhysRevLett.29.705

2. E. L. Elson. Biophys. J., 101 , N 12 (2011) 2855—2870, doi: 10.1016/j.bpj.2011.11.012

3. M. A. Hink. Protoplasma, 251 , N 2 (2014) 307—316, doi: 10.1007/S00709-013-0602-Z

4. R. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P. Kask. Eur. Biophys. J., 22 , N 3 (1993) 169—175, doi: 10.1007/BF00185777

5. S. T. Hess, W. W. Webb. Biophys. J., 83 , N 4 (2002) 2300—2317, doi: 10.1016/S0006-3495(02)73990-8

6. E. L. Elson, D. Magde. Biopolymers, 13 , N 1 (1974) 1—27, doi: 10.1002/BIP.1974.360130102

7. Y. Chen, J. D. Müller, P. T. C. So, E. Gratton. Biophys. J., 77 , N 1 (1999) 553—567, doi: 10.1016/S0006-3495(99)76912-2

8. P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 , N 24 (1999) 13756—13761, doi: 10.1073/PNAS.96.24.13756

9. В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2008) 31—35

10. В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Вестн. Бел. гос. ун-та. Сер. 1, Физика. Математика. Информатика, 2 (2016) 52—59

11. Lan Yu, Yunze Lei, Ying Ma, Min Liu, Juanjuan Zheng, Dan Dan, Peng Gao. Front Phys., 9 (2021) 110, doi: 10.3389/FPHY.2021.644450/BIBTEX

12. A. Kitamura, M. Kinjo. Int. J. Mol. Sci., 19 , N 4 (2018) 964, doi: 10.3390/IJMS19040964

13. L. M. Nederveen-Schippers, P. Pathak, I. Keizer-Gunnink, A. H. Westphal, P. J. M. van Haastert, J. W. Borst, A. Kortholt, V. V. Skakun. Int. J. Mol. Sci., 22 , N 14 (2021) 7300, doi: 10.3390/IJMS22147300

14. K. Palo, Ü. Mets, S. Jäger, P. Kask, K. Gall. Biophys. J., 79 , N 6 (2000) 2858—2866, doi: 10.1016/S0006-3495(00)76523-4

15. B. Huang, T. D. Perroud, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 5 , N 10 (2004) 1523—1531, doi: 10.1002/CPHC.200400176

16. J. D. Müller. Biophys. J., 86 , N 6 (2004) 3981—3992, doi: 10.1529/biophysj.103.037887

17. B. Wu, R. H. Singer, J. D. Mueller. Methods Enzymol., 518 (2013) 99—119, doi: 10.1016/B978-0-12-388422-0.00005-4

18. V. V. Skakun, A. V. Digris, V. V. Apanasovich. Methods Mol. Biol., 1076 (2014) 719—741, doi: 10.1007/978-1-62703-649-8_33

19. J. M. Beechem. Methods Enzymol., 210 , N C (1992) 37—54, doi: 10.1016/0076-6879(92)10004-W

20. V. V. Skakun, M. A. Hink, A. V. Digris, R. Engel, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, A. J. W. G. Visser. Eur. Biophys. J., 34 , N 4 (2005) 323—334, doi: 10.1007/s00249-004-0453-9

21. M. A. Digman, R. Dalal, A. F. Horwitz, E. Gratton. Biophys J., 94 , N 6 (2008) 2320—2332, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.107.114645

22. J. R. Unruh, E. Gratton. Biophys. J., 95 , N 11 (2008) 5385—5398, doi: 10.1529/BIOPHYSJ.108.130310

23. H. Balasubramanian, J. Sankaran, S. Pandey, C. J. H. Goh, T. Wohland. Biophys. J., 121 , N 23 (2022) 4452—4466, doi: 10.1016/j.bpj.2022.11.003

24. V. V. Skakun, E. G. Novikov, V. V. Apanasovich, H. J. Tanke, A. M. Deelder, O. A. Mayboroda. Eur. Biophys. J., 35 , N 5 (2006) 410—423, doi: 10.1007/s00249-006-0048-8

25. V. V. Skakun, E. G. Novikov, T. V. Apanasovich, V. V. Apanasovich. Methods Appl. Fluoresc., 3 , N 4 (2015) 045003, doi: 10.1088/2050-6120/3/4/045003

26. G. J. Kremers, J. Goedhart, D. J. Van Den Heuvel, H. C. Gerritsen, T. W. J. Gadella. Biochemistry, 46 , N 12 (2007) 3775—3783, doi: 10.1021/BI0622874

27. J. R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer, New York (2006), doi: 10.1007/978-0-387-46312-4

28. В. В. Скакун, В. В. Апанасович. Журн. БГУ. Физика, 2 (2023) 22—38, doi: 10.33581/2520-2243-2023-2-22-38

29. M. L. Johnson, L. M. Faunt. Methods Enzymol., 210 (1992) 1—37, doi: 10.1016/0076-6879(92)10003-V

30. T. D. Perroud, B. Huang, R. N. Zare. Chem. Phys. Chem., 6 , N 5 (2005) 905—912, doi: 10.1002/cphc.200400547

31. P. R. Bevington, D. K. Robinson. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences, 3rd ed., McGraw-Hill Publishing Co. (2003), ISBN 0072472278/9780072472271