Анализ стресс-индуцированной генерации активных форм кислорода в протокормах Phalaenopsis ×hybridum blume с использованием редокc-зависимого флуоресцентного зонда дигидроэтидиума

Разработаны методы анализа и исследованы важнейшие стрессовые реакции эпидермальных клеток протокормов Phalaenopsis  ×hybridum Blume — синтеза активных форм кислорода (АФК), в частности, супероксидного анионного радикала (О₂^●–). Для этого адаптирована техника эпифлуоресцентной микроскопии в комбинации с флуоресцентным зондом дигидроэтидиумом и узкополосным флуоресцентным фильтрующим кубом Nikon FITC B-2E/С. Данный подход позволил избежать артефактов, возникающих из-за интенсивной флуоресценции в красной области спектра при связывании этидиума (продукта неспецифического окисления дигидроэтидиума) с ДНК, и успешно зарегистрировать сигнал 2-гидроксиэтидиума (2-OH-E⁺) в зеленой области спектра, специфичный для реакции с О₂^●–. С использованием разработанных методов проведен анализ генерации АФК в протокормах Орхидных при механическом повреждении, а также осмотическом и солевом стрессе. Показано, что вышеуказанные факторы индуцировали генерацию О₂^●– в эпидермисе протокормов (регистрируемую как рост флуоресценции 2-OH-E⁺). Добавление ферментативных и низкомолекулярных антиоксидантов, таких как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, диметилсульфоксид (ДМСО) и тиомочевина, снижало стресс-индуцированный синтез АФК в протокормах. Наибольшее снижение флуоресценции наблюдалось в присутствии СОД и тиомочевины, что указывает на специфичность реакции дигидроэтидиума с О₂^●–. Разработанные подходы могут быть применены для анализа ранних стадий окислительного дисбаланса, развивающегося в клетках Орхидных и других высших растений при воздействии абиотических стресс-факторов среды.

1. Т. М. Черевченко, А. Н. Лаврентьева, Р. В. Иванников. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro, Киев, Наукова думка (2008)

2. R. G. Lopez, E. S. Runkle. Hort. Sci., 40, N 7 (2005) 1969—1973

3. J. C. Cardoso, C. A. Zanello, J. T. Chen. Int. J. Mol. Sci., 21, N 3 (2020) 985

4. C. M. Iiyama, J. A. Vilcherrez-Atoche, M. A. Germanà, W. A. Vendrame, J. C. Cardoso. Heredity (Edinb.), 132, N 4 (2024) 163—178

5. Y.-H. Wu, X.-G. Chen, N.-Q. Li, T.-Q. Li, R. Anbazhakan, J.-Y. Gao. Plants, 14, N 7 (2025) 1024

6. K. Balilashaki, S. Gantait, R. Naderi, M. Vahedi. Physiol. Mol. Biol. Plants., 21, N 3 (2015) 341—347

7. K. Y. Paek, E. J. Hahn, S. Y. Park. Methods Mol. Biol., 710 (2011) 293—306

8. E. C. Yeung. Bot. Stud., 58, N 33 (2017) 1—14

9. B. Ravi, C. H. Foyer, G. K. Pandey. Plant Cell Environ., 46, N 7 (2023) 1985—2006

10. T. Xu, J. Niu, Z. Jiang. Front. Plant Sci., 13 (2022) 925863

11. V. Demidchik, S. Shabala. Functional Plant Biology, 45 (2018) 9—27

12. T. Zhu, X. Cheng, C. Li, Y. Li, C. Pan, G. Lu. Front. Plant Sci., 16 (2025) 1560204

13. V. Demidchik. Int. J. Mol. Sci., 19 (2018) 1263

14. V. Demidchik. Environ. Exp. Bot., 109 (2015) 212—228

15. B. Kalyanaraman, M. Hardy, R. Podsiadly, G. Cheng, J. Zielonka. Arch. Biochem. Biophys., 617 (2017) 38—47

16. S. Zvanarou, R. Vágnerová, V. Mackievic, S. Usnich, I. Smolich, A. Sokolik, M. Yu, X. Huang, K. J. Angelis, V. Demidchik. Environ. Exp. Bot., 180 (2020) 104236

17. E. B. Sözer, I. Semenov, P. T. Vernier. Bioelectrochemistry, 160 (2024) 108751

18. M. P. Murphy, H. Bayir, V. Belousov, C. J. Chang, K. J. A. Davies, M. J. Davies, T. P. Dick, T. Finkel, H. J. Forman, Y. Janssen-Heininger, D. Gems, V. E. Kagan, B. Kalyanaraman, N. G. Larsson, G. L. Milne, T. Nyström, H. E. Poulsen, R. Radi, H. Van Remmen, P. T. Schumacker, P. J. Thornalley, S. Toyokuni, C. C. Winterbourn, H. Yin, B. Halliwell. Nat. Metab., 4, N 6 (2022) 651—662

19. G. Fast. Orcideen Kultur, Stuttgart, Ulmer (1980) 460

20. M. Kouhen, A. Dimitrova, G. S. Scippa, D. Trupiano. Biology (Basel), 12, N 2 (2023) 217

21. V. Mackievic, Y. Li, P. Hryvusevich, D. Svistunenko, I. Seregin, A. Kozhevnikova, A. Kartashov, S. Shabala, V. Samokhina, A. Rusakovich, T. A. Cuin, A. Sokolik, X. Li, X. Huang, M. Yu, V. Demidchik. Plant Physiol. and Biochem., 220 (2025) 109227

22. R. P. Alzola, S. M. Siadat, A. Gajjar, R. Stureborg, J. W. Ruberti, J. Delpiano, C. A. DiMarzio. J. Biomed. Opt., 26, N 7 (2021) 076501

23. H. Zhao, S. Kalivendi, H. Zhang, J. Joseph, K. Nithipatikom, J. Vásquez-Vivar, B. Kalyanaraman. Free Radical Biology and Medicine, 34, N 11 (2003) 1359—1368

24. R. Kumar, R. R. Gullapalli. J. Vis. Exp., 203 (2024), doi: 10.3791/66238

25. B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge. Free Radicals in Biology and Medicine, 5th еd., New York, Oxford University Press (2015)

26. V. Demidchik. In: Plant Stress Physiology, Ed. S. Shabala, Wallingford, CAB International (2017) 64—96

27. B. Gironi, Z. Kahveci, B. McGill, B. D. Lechner, S. Pagliara, J. Metz, A. Morresi, F. Palombo, P. Sassi, P. G. Petrov. Biophys. J., 119, N 2 (2020) 274—286

28. P. L. Popham, A. Novacky. Plant Physiol., 96, N 4 (1991) 1157—1160

29. A. K. Prasad, P. C. Mishra. Chem. Phys. Lett., 684 (2017) 197—204

30. R. Michalski, B. Michalowski, A. Sikora, J. Zielonka, B. Kalyanaraman. Free Radical Biology and Medicine, 67 (2014) 278—284

31. G. F. Dias, R. S. d. Alencar, P. M. O. d. Viana, I. E. Cavalcante, E. S. D. d. Farias, S. I. Bonou, J. R. S. d. Sales, H. A. Almeida, R. L. S. d. Ferraz, C. F. d. Lacerda. Horticulturae, 11 (2025) 438

32. X. J. Wang, C. S. Loh, H. H. Yeoh, W. Q. Sun. J. Exp. Bot., 53, N 368 (2002) 551—558

33. R. Munns, M. Tester. Annu. Rev. Plant Biol., 59 (2008) 651—681

34. L. X. Xu, X. Xin, G. K. Yin, J. Zhou, Y. C. Zhou, X. X. Lu. Sci. Rep., 10 (2020) 13294

35. M. U. Alam, M. Fujita, K. Nahar, A. Rahman, T. I. Anee, A. A. Chowdhury Masud, A. K. M. Ruhul Amin, M. Hasanuzzaman. Plant Stress, 6 (2022) 100120

36. C. Kaya, M. Ashraf, O. Sonmez. Turkish J. Botany, 39, N 5 (2015) 786—795

37. J. Sembi, D. Ghai, J. Verma. In: Molecular Approaches in Plant Biologyand Environmental Challenges, Ed. P. Singh, Singapore, Springer Nature (2019) 449—473

38. C. He, Z. Yu, J. A. Teixeira da Silva, J. Zhang, X. Liu, X. Wang, X. Zhang, S. Zeng, K. Wu, J. Tan, G. Ma, J. Luo, J. Duan. Sci. Rep., 7 (2017) 41010

39. N. Swagata, K. Suman. Phytochemistry, 156 (2018) 176—183

40. J. W. Li, X. D. Chen, X. Y. Hu, L. Ma, S. B. Zhang. Planta, 247, N 1 (2018) 69—97

41. C. Zhang, J. Chen, W. Huang, X. Song, J. Niu. Front Genet., 12 (2021) 692702

42. X. Qin, Y. Liu, S. Mao, T. Li, H. Wu, C. Chu, Y. Wang. Euphytica, 177, N 1 (2011) 33—43

43. Y. Fan, J. Ma, Y. Liu, X. Tan, X. Li, E. Xu, L. Xu, A. Luo. Int. J. Mol. Sci., 24, N 19 (2023) 14692

44. H. Fan, T. Li, L. Guan, Z. Li, N. Guo, Y. Cai, Y. Lin. Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 109 (2012) 307—314

45. R. K. Tewari, P. Kumar, S. Kim, E. J. Hahn, K. Y. Paek. Plant Cell Rep., 28, N 2 (2009) 267—279

46. P. Amnuaykan, S. Juntrapirom, W. Kanjanakawinkul, W. Chaiyana. Plants (Basel), 13, N 13 (2024) 1770